PCR檢查支原體是對藥典方法的重要補充

支原體是導致體外細胞污染的重要污染源。用于生物制品生產(chǎn)的細胞基質(zhì)或治療性細胞。產(chǎn)品被支原體污染后，支原體或支原體代謝產(chǎn)物可進入人體，并對人體產(chǎn)生嚴重危害。因此，對支原體污染的有效檢測是確保細胞基質(zhì)及治療性細胞產(chǎn)品質(zhì)量的前提。

支原體傳統(tǒng)檢測方法為培養(yǎng)法和指示細胞染色法，這兩種均是“藥典方法”。但缺點是耗時長，靈敏度低。此外，這兩種方法均無法明確所感染支原體的類型。

因此，采用PCR或qPCR檢測支原體的高度保守序列，用于制藥工業(yè)的放行檢測，逐漸成為一種趨勢。當然，核酸擴增法也存在一定的問題，因為它檢的不是活的支原體，而是支原體的DNA。另外，它容易受到樣本基質(zhì)中的物質(zhì)干擾，如果靈敏度達不到，有時容易漏檢。而培養(yǎng)法的問題是，有些支原體無法在培養(yǎng)基上生長，因此也不會被發(fā)現(xiàn)。而核酸擴增法可以覆蓋100多種支原體，且大大節(jié)省時間，并且擴增產(chǎn)物還可測序，以終確定污染支原體的物種，增加可追溯性。因此還是值得大力推廣。

現(xiàn)在，市面上有些商品化試劑盒可以挑選，但需要注意它們應達到歐洲藥典或日本藥典標準，例如靈敏度、耐用性和特異性方面，需要經(jīng)過全面驗證。下面以德國MB公司的試劑盒（Venor®GeM qEP）為例，對這類試劑盒略做介紹。

該試劑盒擴增柔膜體對應的16S rRNA上的特異序列， 而真核細胞和其他細菌DNA不會被擴增。
 
試劑盒可同時對細胞培養(yǎng)上清篩查以及那些需要遵循歐洲藥典和日本藥典放行檢測。整個檢測小于3小時。和一些生化和細胞學方法相比，PCR具有更高的靈敏度和準確性。
 
試劑盒包含所有必要的PCR組分，包括引物和探針。其中內(nèi)控DNA可用于鑒定PCR抑制或DNA抽提問題帶來的假陰性。內(nèi)控DNA可直接加到PCR預混液里，或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗證DNA抽提和qPCR擴增過程。內(nèi)控對照的擴增結(jié)果在560nm檢測（HEX通道），而支原體的擴增在520nm檢測（FAM通道）。
 
試劑盒包括dUTP，它替代dTTP，方便用尿嘧啶DNA糖基酶（UNG）監(jiān)視假陽性。該試劑盒不包含UNG。

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