支原體 DNA染色法及其優缺點

支原體有多種檢查方法，其中熒光法檢測支原體DNA是藥典記載的方法，又被稱為DNA染色法或指示細胞培養法。它的原理和操作大致如下：

將供試品接種于指示細胞（無污染的Vero 細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞，供試品應對該細胞生長無影響。下面以Vero細胞為例）中培養后，用特異熒光染料（如Hoechst 33258）染色。

Vero 細胞經消化后，需制成每1ml含10的5次方的細胞懸液，以每孔0. 5ml接種到6孔細胞培養板。每孔再加無抗生素DMEM培養基3ml，在細胞孵箱培養過夜，備用。

無抗生素培養基中加入供試品后，細胞需至少傳一代，然后取細胞已長滿且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。

在制備好的指示細胞培養板中加入2ml待檢細胞培養上清，36°C培養3-5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次，末次傳代培養用含蓋玻片的6孔細胞培養板培養3-5 天后，吸出培養孔中的培養液，加入固定液5ml，放置5分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10分鐘。再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥，加

DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，洗3 次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。

陰性對照僅見指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。陽性對照熒光顯微鏡下除細胞外，可見大小不等、不規則的熒光著色顆粒。有污染的供試品表現應與陽性對照相同。

支原體DNA染色法的優勢是：

1.適用于一些不易培養的支原體，如豬鼻支原體，分離培養法對該支原體檢測并不可靠，但可用DNA染色法準確地檢測出來。

2. 操作簡單

3. 靈敏度尚可。

支原體DNA染色法的不足是：

1. 需4-14天后才出結果，時間較長。

2. 存在有假陽性和假陰性。如一些死亡細胞釋放出來的DNA會造成很大干擾，使得判斷誤差發生率大約在30%左右，因此使用這個方法需要一定的經驗。

因此，目前有一種趨勢是進行支原體常規PCR和支原體qPCR的檢測，只要支原體方法驗證保證其靈敏度、特異性和穩定性，只要該方法與藥典方法相比具有可比性，即可代替培養法或DNA染色法。

方法驗證可通過一些支原體標準品來進行，同時需要注意的是，樣本都需經過DNA抽提，否則其中可能含有抑制PCR反應的物質，導致靈敏度下降。

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