支原體標準品的品控是保證質量的關鍵

生物制品和細胞治療企業已越來越多地采用核酸法進行支原體的檢查和生產質控。核酸法如替代藥典方法，則需進行方法驗證。

現在一些地方在使用德國MB公司的支原體標準品或支原體基因組DNA（定量標準品），包括靈敏度標準品（10CFU,100CFU）、特異性標準品以及PCR定量標準品，其中靈敏度標準品也可用于耐用性的驗證。

MB廠家具有ISO 9001和ISO 13485質量體系認證。每個批次支原體標準品都有驗證和質控。同時支原體培養所用的培養基每個批次都符合歐洲藥品質量管理局（EDQM）的標準。標準品每個批次都提供有質控證書（COA）。標準品所用的支原體菌株來自英國NCTC菌種保藏中心，同時具有相應的ATCC編號。

下面對MB廠家的三類標準品的質控方面做一介紹。

（一）支原體靈敏度標準品

10CFU™支原體靈敏度標準品為滅活支原體，這樣不會對實驗室造成支原體污染。它用于核酸法的靈敏度和耐用性驗證。它每盒含3管10CFU支原體凍干粉，2管陰性對照。靈敏度標準品主要經過下列三方面的質控：

1. 功能檢測：

即標準品復溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit），再用符合藥典標準的qPCR試劑盒檢測，應保證有擴增曲線。

2. 活力檢測：

即標準品在培養基中復溶并培養7天后，再進行DNA抽提和qPCR檢測，Ct值和對照組比，應不超過允許閾值（ΔCt >2）。該檢測主要是確保支原體均已滅活。

3.di閾限檢測和批次合格標準：

標準品用DMEM+5%FCS進行10倍梯度稀釋，形成3個稀釋度，DNA抽提后然后進行前后3輪qPCR檢測，每輪每個稀釋度重復8次。每種支原體的Ct平均值應達到一定標準，方為合格。

（二）支原體基因組DNA——特異性驗證用

該基因組DNA是從相應的支原體中抽提出來，并制成凍干粉。每管為10ng左右。復溶時，每管加100ml廠家提供的Tris緩沖液，室溫靜置5分鐘，再渦旋離心5秒鐘。

廠家對基因組中的16S rRNA段進行了序列分析，要求應與相應支原體物種的同源性應達到99%以上。對制備的DNA質量和數量進行了熒光分析和PCR擴增。PCR擴增應顯示為單一的擴增條帶。

（三）PCR定量標準品

每管為1x108拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉，使用時也是先用廠家提供的Tris緩沖液復溶。質控時，對16S rRNA的部分序列進行測序分析，以鑒定支原體物種，測序結果應顯示為99%以上的同源性。再對該標準品作系列梯度稀釋，再進行qPCR擴增，應顯示為良好的線性。該方法還可確定qPCR方法的檢測閾值。

MB公司的上述三類標準品可用于對支原體核酸法的方法學驗證，包括靈敏度、特異性和耐用性。其中，基因組DNA除了包括常見支原體物種外，還包括一些常見細菌，用于驗證常規PCR或qPCR的檢測是否會產生交叉反應。

總之，良好的質控是標準品品質的保證，這樣才能確保方法驗證結果的可靠性，使支原體的核酸法檢測符合藥典所規定的標準，從而為替代培養法等經典支原體的檢測方法提供數據支持。

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