活細胞觀察活性染料固定染色法

一.活細胞觀察

鏡下觀察：

細胞無色透明，倒置顯微鏡或相差顯微鏡觀察細胞形態結構：細胞膜和細胞質。

生長狀態好:胞內無顆粒,不見空氣,胞膜清晰,上清液透明，無懸浮細胞和碎片。

生長狀態不好：胞質出現空氣脂滴和顆粒狀物，細胞之間的空隙加大細胞形態不規則。

1.活性染料：

原理：能進入活細胞,一些無毒或毒性很小的染料,電性吸引而堆積在細胞中某些特定的結構從而顯色,不引起物理和化學變化,對細胞生命活動不會產生影響或影響很少。

包括：中性紅、結晶紫、健那綠、次甲基藍、甲苯胺藍、亮焦油紫。

特點：它們解離后帶正電荷，屬堿性染料與胞內構造有一些結合。

二．固定染色方法

1．固定：迅速殺死細胞再染色進行觀察。

目的：使細胞內的蛋白質、脂肪、核酸及糖等轉變為不溶性物質，避免自溶腐bai。固定的細胞保持原有結構，保存時間長。

由于固定劑性能不同，如一種固定劑對某種結構保存效果好，但對別的結構就不一定適合，染色劑對細胞內的各種化學成分有不同的親和力，所以每種組織通常有一些特定的固定染色方法。

一.常用固定劑包括:

1.75％酒精、

2.4％多聚甲醛（多聚甲醛為粉末狀，緩慢加入在60℃水浴中溶化），

3.甲醛/冰醋酸（冰醋酸1份：甲醛3份），

4.FAA（80％乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福爾馬林5ml）

5.中性福爾馬林：福爾馬林10ml、Na2HPO4(無水)0.78g、NaH2PO4(無水)0.42g加0.85%NaCl至100ml。

6.Carnory固定液：純酒60ml、氯仿30ml、冰醋酸10ml。

二. 染色方法：

使死細胞著色的大多數是酸性染料，它們不易穿透活細胞的質膜，進入胞內，卻能滲進死亡的細胞，使死細胞著色。

（1）臺盤藍(trypan bule)

0.4%～1%溶于生理鹽水，pH7.0～7.2，取0.1ml/ml細胞懸液染色2分鐘后鏡下觀察死細胞為藍色。此染色時間不易過長，有毒性，如染15分鐘以上，活細胞會受到損傷而著色。另外，臺盤藍不宜久存時間長了有毒性。（藍色）

（2）苯胺黑 (Amiline black)

0.05%苯胺黑Hanks溶液以1：10量細胞懸液混合1～2分鐘后，鏡下觀察：死細胞著黑色，苯胺黑染料毒性很小。

（3）赤蘚紅B(Erythrosin B)

PBS或Hanks溶液洗去血清取細胞與0.02%赤蘚紅B混合，兩小時之內鏡檢:死細胞著紅色。

（4）伊紅Y(Eosin Y)

細胞懸液與7倍量的0.15%伊紅Y染液（生理鹽水配制）混合2分鐘后鏡檢，死細胞為桃紅色。

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