細胞凍存『掃雷指南』，這些關鍵點必看！

細胞凍存

細胞凍存是細胞實驗中的一個常規步驟，是細胞保存的重要方法之一。將細胞低溫保存在-196℃液氮中，使細胞暫時脫離生長狀態而進入休眠階段，以便日后復蘇重新培養擴增。

細胞凍存方法

細胞凍存實驗，在往期文章中也有提到

保姆級細胞凍存方法

看似簡單的實驗，仍有一些關鍵點需要格外留意，切莫踩到“雷區"，造成“實驗大翻車"。

凍存操作前：

選擇長勢良好、存活率高，且生長密度在80%—90%的細胞進行凍存。

需對細胞進行雜質檢測：是否有雜細胞或者支原體等雜質。

這里推薦使用MB支原體常規法PCR檢測試劑盒，非定量檢測，常規PCR即可滿足需求，方便快捷，靈敏度高。

所用凍存試劑DMSO應為分析級，避光儲存。

凍存前一日，對需保存的細胞進行換液處理。

凍存操作

配制凍存培養基（常規含量）：DMSO含量5-10%，血清含量20%左右。

用凍存培養基將離心后的細胞進行重懸。

分裝至無菌凍存管中。

梯度降溫：

4℃ 10 分鐘

?

-20℃ 30 分鐘

?

-80℃ 16～18 小時

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液氮

或將裝有細胞的凍存管，置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱中，一天后轉移至液氮中。

液氮的液相儲存與氣相儲存

一般認為：-196℃的液氮，對于需要長期保存的細胞而言，是一比較合適的環境。因此，我們會將裝有細胞的凍存管，放入專用的方形凍存盒中，再裝進液氮罐配套的提籃提籃中，浸入液氮的液相中進行保存。

但在液相中長期儲存，容易面臨以下問題：

如果凍存管在罐內密封不嚴，則會引起液氮滲入管內，灌滿整個樣品管，造成樣品的污染。不僅如此，在取出凍存管的時候，液氮沸騰氣化使管內氣壓升高，發生炸裂，容易傷到實驗人員。

因此，有人提出，可以將細胞置于液氮的氣相中進行儲存。

液氮罐內溫度較比液相儲存高，一般在-135℃至-190℃，對于細胞儲存而言，該溫度也符合要求，但在實際操作過程中，也存在一定弊端：

與液相液氮罐相比，氣相液氮罐，在相同體積的液氮中保存時間更短，需對液氮罐內的溫度進行監控，及時補充液氮來維持罐內溫度。

所以，應根據實驗環境、實驗條件等情況，合理選擇液相儲存或是氣相儲存。在正確操作的前提下，這兩者都能達到比較好的凍存效果