dPCR概念及操作步驟詳解

數字聚合酶鏈反應（Digital PCR，dPCR）是一種高度靈敏和準確的核酸檢測技術，它通過將目標分子在大量微小反應單元中進行數字化擴增和檢測，實現對稀有或低拷貝數目標的可靠定量。本文將詳細介紹dPCR技術的原理，包括樣本分割、擴增、測定和數據分析的步驟，以幫助讀者深入理解這一先進的生物分析技術。

引言

聚合酶鏈反應（PCR）作為一種常用的核酸擴增技術，已在分子生物學、醫學診斷和生物工程等領域發揮著重要作用。然而，傳統PCR技術在檢測低拷貝數目標時存在靈敏度不足、精確度有限等局限性。為了克服這些限制，dPCR技術應運而生。

dPCR的基本原理

dPCR的基本原理是將樣本中的目標分子均勻地分割成許多微小反應單元，并在每個反應單元中進行PCR擴增。通過對反應單元的陽性和陰性結果進行數字計數，可以確定目標分子的存在與否，從而實現精確定量。

dPCR的步驟

a. 樣本準備：首先，從樣本中提取目標DNA或RNA，并根據需要進行適當的預處理，例如逆轉錄反應或DNA純化等。

b. 樣本分割：將樣本分割成大量微小反應單元，可以使用微滴數字PCR芯片、微流控芯片或數字PCR芯片等分割技術。每個反應單元包含零個或一個目標分子。

c. PCR擴增：在每個微小反應單元中進行PCR擴增。由于每個反應單元中僅包含少量目標分子，使得擴增達到飽和狀態的概率較小，從而減少了PCR擴增效率對結果的影響。

d. 結果測定：通常使用熒光探針、探針水解或熒光染料等方法對PCR產物進行檢測。根據產物是否達到熒光檢測閾值，可以判定每個反應單元是陽性還是陰性。

e. 數據分析：將陽性和陰性結果的數字計數與總反應單元數量相比較，即可得到目標分子的絕對拷貝數，實現對目標分子的精確定量。

dPCR技術的優勢

a. 高靈敏度：dPCR可以檢測稀有或低拷貝數目標，比傳統PCR技術更加敏感。

b. 高準確性：由于數字化的特性，dPCR消除了PCR擴增效率的影響，提供更加準確和可靠的定量結果。

c. 抗抑制性強：dPCR在復雜樣本中的表現優秀，對樣本中存在的抑制物質較為抗拒。

d. 可重復性好：數字化的dPCR技術具有出色的可重復性，可以在不同實驗室和不同時間重現相同的結果。

結論

數字聚合酶鏈反應（dPCR）作為一種高度精確的核酸定量技術，已經在許多領域展現出巨大的潛力和廣泛的應用前景。通過樣本分割、PCR擴增、結果測定和數據分析等步驟，dPCR能夠實現對稀有或低拷貝數目標的可靠定量，為基礎研究、臨床診斷和生物工程等領域的科學研究和技術應用提供了強有力的支持。隨著技術的不斷發展，相信dPCR將在未來發揮越來越重要的作用，推動生物科學領域的進步和創新。