都是qPCR，結(jié)果為何差距這么大？

簡單來說，應(yīng)用該原理的熒光探針，是由熒光基團(tuán)+DNA寡核苷酸+淬滅基團(tuán)構(gòu)成。

探針由5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)、目標(biāo)基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列以及3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)以及與組成。

自然狀態(tài)下，探針完整，熒光報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，儀器不會檢測到熒光信號。

當(dāng)存在目標(biāo)序列時，目標(biāo)DNA變性解鏈，熒光探針特異性結(jié)合到目標(biāo)基因處。引物也結(jié)合在目標(biāo)基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能將核苷酸添加到引物中，引物開始延伸。

Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合處，可將探針?biāo)猓篃晒鈭蟾婊鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，進(jìn)而被qPCR儀檢測到熒光信號，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的DNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線"，通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。

熒光探針有許多不同種類，以應(yīng)對不同的實驗需求，該方法特異性高，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領(lǐng)域。

該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料，被激發(fā)后，顯示為綠色熒光。

該染料以一種非特異性方式，與雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域相結(jié)合。游離的染料熒光信號微弱，在進(jìn)行qPCR擴(kuò)增生成dsDNA時，染料逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號被很大程度放大，熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線"，通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。